AlphaFold-Multimer虛擬篩選發現GPCR納米抗體：從概念驗證到前瞻性應用

原文作者：Harvey EP, et al.
發表於：Nature Communications, 2026年

摘要

抗體發現傳統上依賴免疫接種或體外文庫篩選，實驗成本高、週期長。Harvey等人近期在Nature Communications發表的研究表明，AlphaFold-Multimer（AF-M）可用於GPCR靶點的納米抗體虛擬篩選，從10,000個模擬序列中前瞻性鑑定出親和力為20-200 nM的MRGPRX2結合納米抗體，並在細胞功能實驗中得到驗證。

1. 背景：計算抗體發現的需求與現狀

抗體藥物是增長最快的治療性蛋白類別，目前已有超過100種單克隆抗體獲批，800餘種處於臨床開發階段。納米抗體（單域重鏈抗體片段）因其分子量小、結構簡單、生化特性優良，正成為新興的治療性抗體類別。

傳統抗體發現依賴1970年代發展的免疫接種技術，但面臨顯著局限：許多潛在藥物靶點在哺乳動物中序列高度保守，導致免疫失敗；酵母表面展示和噬菌體展示雖可繞過免疫限制，但需要專業設備，且常產生多反應性結合劑。

近年來，AlphaFold2及其後繼模型通過結合蛋白質數據庫（PDB）中的結構數據和多重序列比對（MSA）中的共進化信息，實現了近實驗精度的蛋白質結構預測。然而，抗體-抗原對不存在有意義的共進化關係，模型必須完全依賴PDB中的結構模式進行預測。

2. AF-M預測GPCR-納米抗體結合的能力評估

2.1 對已知複合物結構的預測準確性

研究團隊首先評估了AF-M對已知GPCR-納米抗體複合物的預測能力。以血管緊張素II 1型受體（AT1R）與合成納米抗體AT118-H的複合物為例，AF-M對該複合物的預測與實驗結構高度吻合：

• 整體RMSD：2.9 Å
• 受體部分RMSD：2.9 Å
• 納米抗體部分RMSD：1.8 Å
• CDR環區RMSD：1.52-2.65 Å

值得注意的是，AT118-H誘導AT1R呈現一種此前未見過的構象——受體外側為激活態樣構象，內側為失活態樣構象。AF-M正確預測了這一非典型狀態。

2.2 區分結合劑與非結合劑的基準測試

為系統評估AF-M的區分能力，研究團隊構建了三個基準數據集：

關鍵發現：在GPCR-納米抗體數據集中，七個指標的AUROC超過0.65，其中平均pTM（AUROC = 0.73）和最佳模型pTM（AUROC = 0.71）表現最佳。然而，對於非GPCR膜蛋白和可溶性蛋白，上述指標的AUROC接近0.5，表明AF-M目前無法有效區分這些類別中的真實結合劑與陰性對照。

2.3 高排名樣本的精確率

在虛擬篩選場景中，模型對高排名樣本的精確率（precision）比整體準確率更為關鍵。研究團隊計算了AUC5%（僅評估排名前5%的樣本的精確率）：

• GPCR數據集：AUC5%達到0.93-1.00
• 可溶性蛋白和膜蛋白數據集：AUC5% ≤ 0.22

2.4 與AlphaFold3和ESMFold的比較

• AlphaFold3：GPCR數據集最佳模型ipTM的AUROC為0.74，可溶性蛋白為0.66，但非GPCR膜蛋白數據集無法區分結合與非結合對
• ESMFold：在GPCR數據集上無法區分陽性結合對與陰性對照

當前結論：AF-M在預測GPCR-納米抗體結合方面優於ESMFold，與AlphaFold3表現相當（在GPCR靶點上）。

3. MRGPRX2納米抗體的前瞻性虛擬篩選

3.1 篩選策略設計

研究團隊以MRGPRX2（MAS相關G蛋白偶聯受體X2）為靶點進行前瞻性篩選。MRGPRX2調節IgE非依賴性肥大細胞脫顆粒，是治療假性過敏反應和瘙癢的潛在靶點。選擇該受體的理由包括：

• 其淺表結合口袋意味著更寬容的熱力學景觀
• 僅存在於靈長類動物中，與MRGPRX1/3/4序列相似性低
• 尚無FDA批准藥物靶向該受體
• MRGPRX2結構在AF-M訓練截止日期之後才存入PDB

研究團隊基於此前發表的酵母展示納米抗體文庫設計參數，生成了10,000個模擬納米抗體序列。CDR3長度分別為7、11和15個殘基，氨基酸分佈匹配已發表文庫。

3.2 篩選流程與過濾

使用AF-M（無模板模式）預測10,000個MRGPRX2-納米抗體複合物結構，按LCF排序。排除存在潛在缺陷的序列（CDR區糖基化位點、預測多反應性），約25%的序列被過濾。最終179個納米抗體（1.79%）的LCF超過GPCR基準數據集中陰性對照的最高LCF。

研究團隊選擇了排名前6位且無缺陷的納米抗體進行表達純化，同時選擇4個排名較低的納米抗體以廣泛採樣。最終10個候選納米抗體進入實驗驗證。

3.3 實驗驗證結果

細胞結合實驗：在表達MRGPRX2的ROSA肥大細胞系中，排名1（Sim8619）、5（Sim9877）、7（Sim4784）和90（Sim4177）的納米抗體顯示高水平結合，而陰性對照Nb60無顯著結合。

在轉染MRGPRX2的HEK293T細胞中，三個納米抗體表現出與ROSA細胞相似的結合特性和解離常數，證實其特異性結合MRGPRX2：

功能活性驗證：

• 激動劑活性：Sim8619、Sim9877和Sim4784不誘導肥大細胞脫顆粒，表明它們不是功能性激動劑
• 拮抗劑活性：三個納米抗體均能減弱化合物48/80誘導的脫顆粒，提示其為功能性拮抗劑
• G蛋白信號實驗：Sim8619不直接激活Gi蛋白，但預處理可降低48/80的G蛋白活性Emax並右移EC50

4. 預測結合模式的結構驗證

AF-M預測Sim8619、Sim9877和Sim4784均結合於MRGPRX2的正構口袋，與化合物48/80結合位點重疊。Sim8619和Sim4784的CDR3中的精氨酸殘基模擬了48/80帶正電荷側基與受體E164和D184的相互作用。

研究團隊通過突變實驗驗證了預測結合模式：

• 納米抗體突變：Sim8619的R102A突變導致結合親和力降低約2倍，最大結合量下降
• 受體突變：MRGPRX2的E164A/D184A雙突變顯著降低Sim8619和Sim4784的結合，但對Sim9877無顯著影響——與AF-M預測一致
• 額外CDR突變：多個預測會破壞MRGPRX2相互作用的CDR突變均降低親和力

這些結果支持AF-M能夠準確預測納米抗體的結合姿態。

5. 討論與局限

5.1 主要貢獻

該研究提供了AF-M用於GPCR納米抗體虛擬篩選的概念驗證。從10,000個模擬序列中，研究團隊通過計算篩選和實驗驗證，鑑定出三個納摩爾親和力、具有功能性拮抗劑活性的MRGPRX2納米抗體。這一流程完全繞過了傳統的免疫接種或體外展示篩選步驟。

5.2 關鍵局限

• 靶點特異性限制：AF-M目前僅對GPCR靶點表現出可靠的區分能力。對可溶性蛋白和非GPCR膜蛋白，AF-M無法有效區分結合劑與非結合劑
• 文庫設計依賴：該研究使用的模擬文庫基於已發表的酵母展示文庫參數。對於更具挑戰性的GPCR靶點，可能需要更大的計算文庫
• MRGPRX2的特殊性：MRGPRX2被選為測試靶點部分原因是其"promiscuous binder"特性——淺表結合口袋可容納廣泛的帶電配體
• 缺乏實驗結構驗證：由於MRGPRX2純化技術困難，研究團隊未能獲得納米抗體-MRGPRX2複合物的實驗結構
• 計算資源需求：10,000個AF-M預測需要相當可觀的計算資源（研究使用NVIDIA A100 GPU）

5.3 競爭格局

該研究並非計算抗體發現領域的唯一進展。近期其他方法也報告了成功：

• Chai-2：多模態生成模型，成功鑑定多個GPCR的納米抗體，包括功能性激動劑
• JAM：生成針對多跨膜蛋白（包括GPCR）的VHH
• RFdiffusion、BoltzGen、Germinal、mBER：報告了多種靶點類型的納米抗體發現

5.4 未來方向

• 擴大計算文庫：結合貝葉斯優化/主動學習方法，從子集篩選中學習氨基酸結合貢獻
• 訓練數據增長：隨著PDB中抗體-蛋白結構持續增加，AF-M及類似模型的預測能力有望進一步提升
• GPCR抗體治療：約35%的FDA批准藥物靶向GPCR，但目前僅有3種GPCR靶向單抗獲批。計算發現方法可能降低GPCR抗體發現的技術門檻

6. 結論

Harvey等人的研究表明，AlphaFold-Multimer可作為GPCR納米抗體虛擬篩選的有效工具，從大規模計算文庫中前瞻性鑑定功能性結合劑。該方法目前僅限於GPCR靶點，且受限於計算資源和靶點特性。儘管如此，這一概念驗證為計算化抗體發現流程提供了重要基礎，未來隨著模型改進和訓練數據增長，其應用範圍有望進一步擴展。

參考資料

Harvey, E.P. et al. In silico discovery of nanobody binders to a G-protein coupled receptor using AlphaFold-Multimer. Nat Commun (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-72093-5

本文基於Harvey等人2026年發表於Nature Communications的研究撰寫，旨在為專業從業者提供客觀的技術解讀。