原文作者：Harvey EP, et al.
发表于：Nature Communications, 2026年
摘要
抗体发现传统上依赖免疫接种或体外文库筛选，实验成本高、周期长。Harvey等人近期在Nature Communications发表的研究表明，AlphaFold-Multimer（AF-M）可用于GPCR靶点的纳米抗体虚拟筛选，从10,000个模拟序列中前瞻性鉴定出亲和力为20-200 nM的MRGPRX2结合纳米抗体，并在细胞功能实验中得到验证。
1. 背景：计算抗体发现的需求与现状
抗体药物是增长最快的治疗性蛋白类别，目前已有超过100种单克隆抗体获批，800余种处于临床开发阶段。纳米抗体（单域重链抗体片段）因其分子量小、结构简单、生化特性优良，正成为新兴的治疗性抗体类别。
传统抗体发现依赖1970年代发展的免疫接种技术，但面临显著局限：许多潜在药物靶点在哺乳动物中序列高度保守，导致免疫失败；酵母表面展示和噬菌体展示虽可绕过免疫限制，但需要专业设备，且常产生多反应性结合剂。
近年来，AlphaFold2及其后继模型通过结合蛋白质数据库（PDB）中的结构数据和多重序列比对（MSA）中的共进化信息，实现了近实验精度的蛋白质结构预测。然而，抗体-抗原对不存在有意义的共进化关系，模型必须完全依赖PDB中的结构模式进行预测。
2. AF-M预测GPCR-纳米抗体结合的能力评估
2.1 对已知复合物结构的预测准确性
研究团队首先评估了AF-M对已知GPCR-纳米抗体复合物的预测能力。以血管紧张素II 1型受体（AT1R）与合成纳米抗体AT118-H的复合物为例，AF-M对该复合物的预测与实验结构高度吻合：
- 整体RMSD：2.9 Å
- 受体部分RMSD：2.9 Å
- 纳米抗体部分RMSD：1.8 Å
- CDR环区RMSD：1.52-2.65 Å
值得注意的是，AT118-H诱导AT1R呈现一种此前未见过的构象——受体外侧为激活态样构象，内侧为失活态样构象。AF-M正确预测了这一非典型状态。
2.2 区分结合剂与非结合剂的基准测试
为系统评估AF-M的区分能力，研究团队构建了三个基准数据集：
| 靶点类别 | 阳性结合对 | 阴性非结合对 |
|---|---|---|
| GPCR | 32 | 127 |
| 非GPCR膜蛋白 | 17 | 376 |
| 可溶性蛋白 | 49 | 1,469 |
关键发现：在GPCR-纳米抗体数据集中，七个指标的AUROC超过0.65，其中平均pTM（AUROC = 0.73）和最佳模型pTM（AUROC = 0.71）表现最佳。然而，对于非GPCR膜蛋白和可溶性蛋白，上述指标的AUROC接近0.5，表明AF-M目前无法有效区分这些类别中的真实结合剂与阴性对照。
2.3 高排名样本的精确率
在虚拟筛选场景中，模型对高排名样本的精确率（precision）比整体准确率更为关键。研究团队计算了AUC5%（仅评估排名前5%的样本的精确率）：
- GPCR数据集：AUC5%达到0.93-1.00
- 可溶性蛋白和膜蛋白数据集：AUC5% ≤ 0.22
2.4 与AlphaFold3和ESMFold的比较
- AlphaFold3：GPCR数据集最佳模型ipTM的AUROC为0.74，可溶性蛋白为0.66，但非GPCR膜蛋白数据集无法区分结合与非结合对
- ESMFold：在GPCR数据集上无法区分阳性结合对与阴性对照
当前结论：AF-M在预测GPCR-纳米抗体结合方面优于ESMFold，与AlphaFold3表现相当（在GPCR靶点上）。
3. MRGPRX2纳米抗体的前瞻性虚拟筛选
3.1 筛选策略设计
研究团队以MRGPRX2（MAS相关G蛋白偶联受体X2）为靶点进行前瞻性筛选。MRGPRX2调节IgE非依赖性肥大细胞脱颗粒，是治疗假性过敏反应和瘙痒的潜在靶点。选择该受体的理由包括：
- 其浅表结合口袋意味着更宽容的热力学景观
- 仅存在于灵长类动物中，与MRGPRX1/3/4序列相似性低
- 尚无FDA批准药物靶向该受体
- MRGPRX2结构在AF-M训练截止日期之后才存入PDB
研究团队基于此前发表的酵母展示纳米抗体文库设计参数，生成了10,000个模拟纳米抗体序列。CDR3长度分别为7、11和15个残基，氨基酸分布匹配已发表文库。
3.2 筛选流程与过滤
使用AF-M（无模板模式）预测10,000个MRGPRX2-纳米抗体复合物结构，按LCF排序。排除存在潜在缺陷的序列（CDR区糖基化位点、预测多反应性），约25%的序列被过滤。最终179个纳米抗体（1.79%）的LCF超过GPCR基准数据集中阴性对照的最高LCF。
研究团队选择了排名前6位且无缺陷的纳米抗体进行表达纯化，同时选择4个排名较低的纳米抗体以广泛采样。最终10个候选纳米抗体进入实验验证。
3.3 实验验证结果
细胞结合实验：在表达MRGPRX2的ROSA肥大细胞系中，排名1（Sim8619）、5（Sim9877）、7（Sim4784）和90（Sim4177）的纳米抗体显示高水平结合，而阴性对照Nb60无显著结合。
在转染MRGPRX2的HEK293T细胞中，三个纳米抗体表现出与ROSA细胞相似的结合特性和解离常数，证实其特异性结合MRGPRX2：
| 纳米抗体 | 排名 | 结合特性 |
|---|---|---|
| Sim8619 | 1 | 高亲和力，特异性结合 |
| Sim9877 | 5 | 高亲和力，特异性结合 |
| Sim4784 | 7 | 高亲和力，对MC4R有轻微脱靶结合 |
功能活性验证：
- 激动剂活性：Sim8619、Sim9877和Sim4784不诱导肥大细胞脱颗粒，表明它们不是功能性激动剂
- 拮抗剂活性：三个纳米抗体均能减弱化合物48/80诱导的脱颗粒，提示其为功能性拮抗剂
- G蛋白信号实验：Sim8619不直接激活Gi蛋白，但预处理可降低48/80的G蛋白活性Emax并右移EC50
4. 预测结合模式的结构验证
AF-M预测Sim8619、Sim9877和Sim4784均结合于MRGPRX2的正构口袋，与化合物48/80结合位点重叠。Sim8619和Sim4784的CDR3中的精氨酸残基模拟了48/80带正电荷侧基与受体E164和D184的相互作用。
研究团队通过突变实验验证了预测结合模式：
- 纳米抗体突变：Sim8619的R102A突变导致结合亲和力降低约2倍，最大结合量下降
- 受体突变：MRGPRX2的E164A/D184A双突变显著降低Sim8619和Sim4784的结合，但对Sim9877无显著影响——与AF-M预测一致
- 额外CDR突变：多个预测会破坏MRGPRX2相互作用的CDR突变均降低亲和力
这些结果支持AF-M能够准确预测纳米抗体的结合姿态。
5. 讨论与局限
5.1 主要贡献
该研究提供了AF-M用于GPCR纳米抗体虚拟筛选的概念验证。从10,000个模拟序列中，研究团队通过计算筛选和实验验证，鉴定出三个纳摩尔亲和力、具有功能性拮抗剂活性的MRGPRX2纳米抗体。这一流程完全绕过了传统的免疫接种或体外展示筛选步骤。
5.2 关键局限
- 靶点特异性限制：AF-M目前仅对GPCR靶点表现出可靠的区分能力。对可溶性蛋白和非GPCR膜蛋白，AF-M无法有效区分结合剂与非结合剂
- 文库设计依赖：该研究使用的模拟文库基于已发表的酵母展示文库参数。对于更具挑战性的GPCR靶点，可能需要更大的计算文库
- MRGPRX2的特殊性：MRGPRX2被选为测试靶点部分原因是其"promiscuous binder"特性——浅表结合口袋可容纳广泛的带电配体
- 缺乏实验结构验证：由于MRGPRX2纯化技术困难，研究团队未能获得纳米抗体-MRGPRX2复合物的实验结构
- 计算资源需求：10,000个AF-M预测需要相当可观的计算资源（研究使用NVIDIA A100 GPU）
5.3 竞争格局
该研究并非计算抗体发现领域的唯一进展。近期其他方法也报告了成功：
- Chai-2：多模态生成模型，成功鉴定多个GPCR的纳米抗体，包括功能性激动剂
- JAM：生成针对多跨膜蛋白（包括GPCR）的VHH
- RFdiffusion、BoltzGen、Germinal、mBER：报告了多种靶点类型的纳米抗体发现
5.4 未来方向
- 扩大计算文库：结合贝叶斯优化/主动学习方法，从子集筛选中学习氨基酸结合贡献
- 训练数据增长：随着PDB中抗体-蛋白结构持续增加，AF-M及类似模型的预测能力有望进一步提升
- GPCR抗体治疗：约35%的FDA批准药物靶向GPCR，但目前仅有3种GPCR靶向单抗获批。计算发现方法可能降低GPCR抗体发现的技术门槛
6. 结论
Harvey等人的研究表明，AlphaFold-Multimer可作为GPCR纳米抗体虚拟筛选的有效工具，从大规模计算文库中前瞻性鉴定功能性结合剂。该方法目前仅限于GPCR靶点，且受限于计算资源和靶点特性。尽管如此，这一概念验证为计算化抗体发现流程提供了重要基础，未来随着模型改进和训练数据增长，其应用范围有望进一步扩展。
参考资料
Harvey, E.P. et al. In silico discovery of nanobody binders to a G-protein coupled receptor using AlphaFold-Multimer. Nat Commun (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-72093-5
← 返回博客首页本文基于Harvey等人2026年发表于Nature Communications的研究撰写，旨在为专业从业者提供客观的技术解读。