原文作者：Wu D, et al.
發表於：Science Advances, 2024年
摘要
T細胞受體（TCR）對癌症新抗原的識別是抗腫瘤免疫應答和過繼細胞治療的核心機制。Wu等人2024年在Science Advances發表的研究解析了人源TCR N17.1.2與NRAS Q61K/Q61R新抗原肽-HLA-A1複合物的高分辨率晶體結構，揭示了其對突變肽的精細特異性識別機制。研究團隊進一步系統評估了AlphaFold2（TCRmodel2框架）和AlphaFold3對該類免疫識別複合物的建模能力，發現增加採樣數量可顯著提升預測準確性，但對其他NRAS Q61K特異性TCR的預測成功率仍然有限。
1. 背景：新抗原靶向T細胞治療的結構需求
過繼細胞治療（ACT）利用腫瘤特異性T細胞已實現多種轉移性癌症的持久緩解，包括黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、膽管癌和結直腸癌。治療性效應主要由細胞毒性CD8+ T細胞介導，其識別的靶點是惡性轉化過程中體細胞突變產生的新抗原（neoantigens）。
來源於致癌基因驅動突變的新抗原具有特殊的治療價值——這些突變既具有腫瘤特異性，又對癌細胞的適應性和增殖至關重要。RAS蛋白家族（KRAS、NRAS、HRAS）是人類癌症中最常見的突變致癌基因之一。NRAS Q61突變在黑色素瘤中佔比約20%，最常見的兩種突變形式為Q61K和Q61R，與更激進的臨床特徵和更差的預後相關。
2. TCR N17.1.2對新抗原的特異性識別
2.1 結合親和力與特異性
表面等離子體共振（SPR）實驗顯示，TCR N17.1.2對兩種突變新抗原的親和力處於TCR識別的典型範圍內：
| 配體 | 解離常數（KD） | 結合特性 |
|---|---|---|
| NRAS Q61K–HLA-A1 | 1.2 ± 0.1 μM | 中等親和力 |
| NRAS Q61R–HLA-A1 | 3.4 ± 0.2 μM | 中等親和力，較Q61K弱約3倍 |
| 野生型NRAS–HLA-A1 | 無檢測到相互作用（最高200 μM） | 無結合 |
2.2 複合物晶體結構概述
研究團隊解析了N17.1.2–NRAS Q61K–HLA-A1（2.10 Å）和N17.1.2–NRAS Q61R–HLA-A1（2.26 Å）複合物結構。兩個複合物的Cα原子RMSD僅為0.3 Å，表明高度相似的結合模式。
- 經典對角線取向：Vα位於HLA-A1 α2螺旋上方，Vβ位於α1螺旋上方
- TCR-pMHC交叉角：28°（兩個複合物相同）
- 入射角：Q61K複合物5°，Q61R複合物7°
2.3 TCR與MHC的相互作用
N17.1.2與MHC的相互作用呈現顯著的Vα主導特徵。Vα貢獻了71%的MHC接觸，其中germline-encoded的CDR1α環單獨貢獻了36%，超過任何其他CDR。
2.4 對新抗原突變位點的識別機制
N17.1.2埋沒了肽分子70%（273 Ų）的溶劑可及表面。其特異性機制在於：
- 最小化與肽N端和中央區域的相互作用：這些區域在突變型和野生型肽中完全相同
- 聚焦於C端P7 Lys/Arg突變位點：該殘基的突出側鏈是最溶劑暴露的表位特徵
- 關鍵鹽橋：CDR3β的Glu103β與P7 Lys/Arg形成鹽橋，野生型P7 Gln無法複製這一關鍵相互作用
- Vβ主導肽識別：在N17.1.2–NRAS Q61K複合物中，Vβ貢獻了76%的肽接觸
2.5 結合過程中的構象變化
將TCR結合態與游離結構比較，六個CDR環的主鏈RMSD為0.53 Å，全原子RMSD為0.62 Å，無顯著結構差異。因此，N17.1.2的識別機制更接近構象選擇而非誘導契合。
3. AlphaFold對TCR-pMHC複合物的建模評估
3.1 建模策略與評估指標
研究團隊系統比較了三種AlphaFold實現方案：
- AlphaFold2.3（默認）：每複合物生成25個模型
- TCRmodel2：基於AlphaFold2.3的TCR-pMHC專用框架，默認生成5個模型；擴展採樣生成1000個模型
- AlphaFold3：通過web server生成5個模型
3.2 N17.1.2複合物的建模結果
| 協議 | 模型置信度 | I-pLDDT | I-RMSD | CAPRI精度 | DockQ |
|---|---|---|---|---|---|
| AF2.3 (25 models) | 0.88-0.89 | 81.6-82.2 | 4.70-4.91 | 不正確 | 0.25 |
| TCRmodel2 (5 models) | 0.87-0.88 | 79.3-84.3 | 4.11-7.10 | 可接受/不正確 | 0.14-0.28 |
| TCRmodel2 (1000 models) | 0.92 | 93.5-94.0 | 0.85-0.88 | 高 | 0.82-0.83 |
| AlphaFold3 (5 models) | 0.94 | 93.5-93.6 | 1.14-1.31 | 中 | 0.73-0.77 |
3.3 模型置信度閾值的建立
研究團隊基於20個TCR-pMHC複合物的基準測試，建立了模型篩選的置信度閾值：
- 組合閾值：模型置信度 > 0.875 且 I-pLDDT > 87.5
3.4 對非結合複合物的建模測試
研究團隊使用TCRmodel2（1000模型）對N17.1.2與野生型NRAS–HLA-A1（無實驗檢測到結合）進行建模。Top-ranked模型顯示與突變新抗原複合物高度相似（I-RMSD 0.81 Å），置信度分數（0.91模型置信度，91.4 I-pLDDT）略低於新抗原複合物模型。這表明AlphaFold無法區分真實結合對與非結合對，即使兩者僅相差一個點突變。
3.5 對其他NRAS Q61K特異性TCR的預測
研究團隊對另外四個已知靶向NRAS Q61K–HLA-A1的TCR進行了建模預測。這些TCR在germline基因和CDR3序列上與N17.1.2不同。結果顯示：
- 使用TCRmodel2（1000模型）、AlphaFold2.3（200模型）和AlphaFold3（5模型）均未產生足夠高的置信度分數
- 未達到預設的模型置信度（>0.875）和I-pLDDT（>87.5）閾值
4. 討論與局限
4.1 新抗原識別的結構原理
該研究揭示了新抗原識別的兩種主要機制之一：TCR通過直接與突變殘基形成關鍵相互作用來區分突變型與野生型肽。對於NRAS Q61K/R，突變位點P7 Lys/Arg的側鏈突出於肽-MHC表面，為TCR提供了明確的識別靶點。N17.1.2通過最小化與肽保守區域的接觸、聚焦突變位點的策略實現了高度特異性。
4.2 AlphaFold建模的成就與邊界
成就：
- TCRmodel2在擴展採樣（1000模型）下可達到CAPRI"高"精度，I-RMSD約0.9 Å
- AlphaFold3在默認設置下達到"中"等精度，優於AlphaFold2.3默認採樣
- 模型置信度分數和I-pLDDT可作為準確性的可靠指標
邊界與局限：
- 採樣依賴性：默認採樣（5-25模型）下預測精度普遍較低，成功建模需要大量採樣（1000模型）
- 無法區分結合與非結合：對無實驗結合的野生型肽複合物仍產生高置信度模型
- 泛化能力有限：對序列不同的其他NRAS Q61K特異性TCR預測成功率低
4.3 對大規模T細胞特異性預測的啟示
該研究對將AlphaFold應用於大規模TCR-pMHC特異性預測提出了審慎評估：
- 當前採樣策略（尤其AlphaFold3 web server的5模型限制）可能不足以保證可靠的預測成功率
- 需要建立更嚴格的置信度閾值（模型置信度 > 0.875且I-pLDDT > 87.5）來篩選可靠模型
- 對於未知TCR-pMHC複合物，假陰性（準確模型但低置信度）和假陽性（高置信度但不準確）的風險並存
5. 結論
Wu等人的研究從結構生物學和計算建模兩個維度，為TCR識別NRAS癌症新抗原提供了重要見解。晶體結構揭示了N17.1.2通過Vα主導MHC識別、Vβ主導肽識別的分工模式，以及對P7突變位點的精確靶向機制。AlphaFold建模評估表明，在充分採樣的條件下，深度學習模型可以準確預測TCR-pMHC複合物結構，但默認採樣設置的可靠性有限，且目前無法區分結合與非結合複合物。這些發現為優化TCR設計和改進計算預測方法提供了有價值的參考框架。
參考資料
Wu, D. et al. Structural characterization and AlphaFold modeling of human T cell receptor recognition of NRAS cancer neoantigens. Sci. Adv. 10, eadq6150 (2024).
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