原文作者：Wu D, et al.
发表于：Science Advances, 2024年
摘要
T细胞受体（TCR）对癌症新抗原的识别是抗肿瘤免疫应答和过继细胞治疗的核心机制。Wu等人2024年在Science Advances发表的研究解析了人源TCR N17.1.2与NRAS Q61K/Q61R新抗原肽-HLA-A1复合物的高分辨率晶体结构，揭示了其对突变肽的精细特异性识别机制。研究团队进一步系统评估了AlphaFold2（TCRmodel2框架）和AlphaFold3对该类免疫识别复合物的建模能力，发现增加采样数量可显著提升预测准确性，但对其他NRAS Q61K特异性TCR的预测成功率仍然有限。
1. 背景：新抗原靶向T细胞治疗的结构需求
过继细胞治疗（ACT）利用肿瘤特异性T细胞已实现多种转移性癌症的持久缓解，包括黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、胆管癌和结直肠癌。治疗性效应主要由细胞毒性CD8+ T细胞介导，其识别的靶点是恶性转化过程中体细胞突变产生的新抗原（neoantigens）。
来源于致癌基因驱动突变的新抗原具有特殊的治疗价值——这些突变既具有肿瘤特异性，又对癌细胞的适应性和增殖至关重要。已有临床先例：
- 一例转移性结直肠癌患者接受靶向KRAS G12D新抗原的CD8+ T细胞克隆治疗后，所有保留HLA-C*08:02表达的转移灶均消退
- 一例化疗难治性乳腺癌患者接受靶向p53 R175H突变的T细胞克隆治疗，实现6个月55%的肿瘤消退
RAS蛋白家族（KRAS、NRAS、HRAS）是人类癌症中最常见的突变致癌基因之一。NRAS Q61突变在黑色素瘤中占比约20%，最常见的两种突变形式为Q61K和Q61R，与更激进的临床特征和更差的预后相关。
2. TCR N17.1.2对新抗原的特异性识别
2.1 结合亲和力与特异性
表面等离子体共振（SPR）实验显示，TCR N17.1.2对两种突变新抗原的亲和力处于TCR识别的典型范围内：
| 配体 | 解离常数（KD） | 结合特性 |
|---|---|---|
| NRAS Q61K–HLA-A1 | 1.2 ± 0.1 μM | 中等亲和力 |
| NRAS Q61R–HLA-A1 | 3.4 ± 0.2 μM | 中等亲和力，较Q61K弱约3倍 |
| 野生型NRAS–HLA-A1 | 无检测到相互作用（最高200 μM） | 无结合 |
这一高度特异性与功能实验一致：转导N17.1.2的T细胞可被亚纳摩尔浓度的突变肽激活，但对野生型肽即使在>1000倍浓度下亦无应答。
2.2 复合物晶体结构概述
研究团队解析了N17.1.2–NRAS Q61K–HLA-A1（2.10 Å）和N17.1.2–NRAS Q61R–HLA-A1（2.26 Å）复合物结构，以及游离TCR结构（3.50 Å）。两个复合物的Cα原子RMSD仅为0.3 Å，表明高度相似的结合模式。
TCR结合取向特征：
- 经典对角线取向：Vα位于HLA-A1 α2螺旋上方，Vβ位于α1螺旋上方
- TCR-pMHC交叉角：28°（两个复合物相同）
- 入射角（TCR相对于pMHC的倾斜度）：Q61K复合物5°，Q61R复合物7°
- 肽N端偏移：与82个参考TCR-pMHC I类复合物相比，N17.1.2的结合位置向肽N端偏移程度超过其中79-80个结构
2.3 TCR与MHC的相互作用
N17.1.2与MHC的相互作用呈现显著的Vα主导特征：
| CDR环 | 与MHC接触贡献（Q61K复合物） |
|---|---|
| CDR1α | 36%（46/128个接触） |
| CDR2α | 9% |
| CDR3α | 26% |
| CDR1β | 0% |
| CDR2β | 16% |
| CDR3β | 13% |
Vα贡献了71%的MHC接触，其中germline-encoded的CDR1α环单独贡献了36%，超过任何其他CDR。
2.4 对新抗原突变位点的识别机制
N17.1.2埋没了肽分子70%（273 Ų）的溶剂可及表面。尽管肽接触比例较低（22%），N17.1.2对突变与野生型NRAS的区分能力卓越。其特异性机制在于：
- 最小化与肽N端和中央区域的相互作用：这些区域在突变型和野生型肽中完全相同
- 聚焦于C端P7 Lys/Arg突变位点：该残基的突出侧链是最溶剂暴露的表位特征
- 关键盐桥：CDR3β的Glu103β与P7 Lys/Arg形成盐桥，野生型P7 Gln无法复制这一关键相互作用
- Vβ主导肽识别：在N17.1.2–NRAS Q61K复合物中，Vβ贡献了76%的肽接触
2.5 结合过程中的构象变化
将TCR结合态与游离结构比较，六个CDR环的主链RMSD为0.53 Å，全原子RMSD为0.62 Å，无显著结构差异。因此，N17.1.2的识别机制更接近构象选择而非诱导契合。
3. AlphaFold对TCR-pMHC复合物的建模评估
3.1 建模策略与评估指标
研究团队系统比较了三种AlphaFold实现方案：
- AlphaFold2.3（默认）：每复合物生成25个模型
- TCRmodel2：基于AlphaFold2.3的TCR-pMHC专用框架，默认生成5个模型；扩展采样生成1000个模型
- AlphaFold3：通过web server生成5个模型
3.2 N17.1.2复合物的建模结果
| 协议 | 模型置信度 | I-pLDDT | I-RMSD | CAPRI精度 | DockQ |
|---|---|---|---|---|---|
| AF2.3 (25 models) | 0.88-0.89 | 81.6-82.2 | 4.70-4.91 | 不正确 | 0.25 |
| TCRmodel2 (5 models) | 0.87-0.88 | 79.3-84.3 | 4.11-7.10 | 可接受/不正确 | 0.14-0.28 |
| TCRmodel2 (1000 models) | 0.92 | 93.5-94.0 | 0.85-0.88 | 高 | 0.82-0.83 |
| AlphaFold3 (5 models) | 0.94 | 93.5-93.6 | 1.14-1.31 | 中 | 0.73-0.77 |
关键发现：
- 默认采样（5-25个模型）下，所有协议的预测精度均较低
- TCRmodel2扩展至1000个模型后，top-ranked模型的精度跃升至CAPRI"高"级别，I-RMSD降至约0.9 Å，DockQ达0.82-0.83
- AlphaFold3在默认5个模型下达到"中"等精度，优于所有默认采样方案
3.3 模型置信度阈值的建立
研究团队基于20个TCR-pMHC复合物的基准测试，建立了模型筛选的置信度阈值：
- 组合阈值：模型置信度 > 0.875 且 I-pLDDT > 87.5
该阈值可进一步富集高精度模型：在8个包含高精度模型的测试案例中，成功识别出6个。
3.4 对非结合复合物的建模测试
研究团队使用TCRmodel2（1000模型）对N17.1.2与野生型NRAS–HLA-A1（无实验检测到结合）进行建模。Top-ranked模型显示与突变新抗原复合物高度相似（I-RMSD 0.81 Å），置信度分数（0.91模型置信度，91.4 I-pLDDT）略低于新抗原复合物模型。这表明AlphaFold无法区分真实结合对与非结合对，即使两者仅相差一个点突变。
3.5 对其他NRAS Q61K特异性TCR的预测
研究团队对另外四个已知靶向NRAS Q61K–HLA-A1的TCR进行了建模预测。这些TCR在germline基因和CDR3序列上与N17.1.2不同。结果显示：
- 使用TCRmodel2（1000模型）、AlphaFold2.3（200模型）和AlphaFold3（5模型）均未产生足够高的置信度分数
- 未达到预设的模型置信度（>0.875）和I-pLDDT（>87.5）阈值
可能的原因包括：这些TCR可能需要更广泛的采样才能获得准确模型；准确模型可能已被预测但置信度分数过低（假阴性）；N17.1.2的成功可能归因于其有限的结合构象变化，使其成为"更容易"的建模目标。
4. 讨论与局限
4.1 新抗原识别的结构原理
该研究揭示了新抗原识别的两种主要机制之一：TCR通过直接与突变残基形成关键相互作用来区分突变型与野生型肽。这与p53 R175H新抗原的识别机制类似。对于NRAS Q61K/R，突变位点P7 Lys/Arg的侧链突出于肽-MHC表面，为TCR提供了明确的识别靶点。N17.1.2通过最小化与肽保守区域的接触、聚焦突变位点的策略实现了高度特异性。
4.2 AlphaFold建模的成就与边界
成就：
- TCRmodel2在扩展采样（1000模型）下可达到CAPRI"高"精度，I-RMSD约0.9 Å
- AlphaFold3在默认设置下达到"中"等精度，优于AlphaFold2.3默认采样
- 模型置信度分数和I-pLDDT可作为准确性的可靠指标
边界与局限：
- 采样依赖性：默认采样（5-25模型）下预测精度普遍较低，成功建模需要大量采样（1000模型）
- 无法区分结合与非结合：对无实验结合的野生型肽复合物仍产生高置信度模型
- 泛化能力有限：对序列不同的其他NRAS Q61K特异性TCR预测成功率低
4.3 对大规模T细胞特异性预测的启示
该研究对将AlphaFold应用于大规模TCR-pMHC特异性预测提出了审慎评估：
- 当前采样策略（尤其AlphaFold3 web server的5模型限制）可能不足以保证可靠的预测成功率
- 需要建立更严格的置信度阈值（模型置信度 > 0.875且I-pLDDT > 87.5）来筛选可靠模型
- 对于未知TCR-pMHC复合物，假阴性（准确模型但低置信度）和假阳性（高置信度但不准确）的风险并存
5. 结论
Wu等人的研究从结构生物学和计算建模两个维度，为TCR识别NRAS癌症新抗原提供了重要见解。晶体结构揭示了N17.1.2通过Vα主导MHC识别、Vβ主导肽识别的分工模式，以及对P7突变位点的精确靶向机制。AlphaFold建模评估表明，在充分采样的条件下，深度学习模型可以准确预测TCR-pMHC复合物结构，但默认采样设置的可靠性有限，且目前无法区分结合与非结合复合物。这些发现为优化TCR设计和改进计算预测方法提供了有价值的参考框架。
参考资料
Wu, D. et al. Structural characterization and AlphaFold modeling of human T cell receptor recognition of NRAS cancer neoantigens. Sci. Adv. 10, eadq6150 (2024).
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